四环素类药物快速检测试剂盒

【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争elisa方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物四环素类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争四环素类药物抗体，加入酶标记物后，用tmb底物显色，样本吸光值与其所含残留物四环素类药物的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物四环素类药物的含量。
【试剂盒技术指标】   
规      格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.05ppb
检测时间： 75min
样本检测下限：
组织样本（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼、鸡蛋）：
四环素 ………………………………………………0.3ppb
二甲胺四环素 ………………………………………0.3ppb
吡四环素 ……………………………………………0.3ppb
金霉素 ………………………………………………0.3ppb
脱甲基金霉素……………………………………… 0.6ppb
土霉素………………………………………………0.6ppb
强力霉素……………………………………………0.9ppb
蜂蜜样本：
四环素……………………………………………… 2ppb
二甲胺四环素……………………………………… 2ppb
吡四环素…………………………………………… 2ppb
金霉素 ………………………………………………2ppb
脱甲基金霉素………………………………………6ppb
土霉素………………………………………………4ppb
强力霉素……………………………………………6ppb
交叉反应率：
四环素 ……………………………………………100%
二甲胺四环素…………………………………… 125%
吡四环素 ………………………………………… 110%
金霉素 …………………………………………… 100%
脱甲基金霉素……………………………………  35%
土霉素 …………………………………………… 58%
强力霉素 ……………………………………………45%      
样本回收率：
组     织   ……………………………………85%±20%
蜂     蜜  …………………………………… 75%±20%
【试剂盒组成】
1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）
2、 标准溶液x6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
3、 酶标记物 12ml…………………………红色帽
4、 抗体工作液   7ml ………………………蓝色帽
5、 底物a液      7ml ………………………白色帽
6、 底物b液     7ml  ……………………黑色帽
7、 终  止  液     7ml ……………………黄色帽
8、 20x浓缩洗涤液40 ml  ………………白色帽
9、 5x 浓缩复溶液   50ml •……………… 透明帽
【 所用仪器、试剂】
具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、刻度移液管
微量移液器：单道 20μl～200μl、单道100μl～1000μl、多道 30～300 μl
试          剂：三氯乙酸、甲醇
【样本前处理步骤】
样本处理前须知
（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，
必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1    样本复溶液
       用去离子水将5×浓缩复溶液按1：4 稀释（1份浓缩复溶液+4 份去离子水）用于样本复溶。
配液2   1%三氯乙酸溶液
       称取1g三氯乙酸加去离子水100ml溶解。
样本处理：
（a）组织、肝脏、鸡蛋（蛋清和全蛋）样本前处理方法（不用过柱）
1、 称取2±0.05g 均质后的样本于50ml 离心管中，加入6ml1%三氯乙酸溶液，振荡2min，室温4000r/min以上，离心10min；
2、 取上清液1ml 加入1ml 甲醇，振荡1min，室温4000r/min 以上，离心10min；
3、 取出1ml 上清液在50～60℃氮气流或空气流吹干，加入1ml 样本复溶液溶解残留的干燥物；
4、 取50 μl 用于分析
    样本稀释倍数: 6 倍
（b）蜂蜜处理方法
1、 准确称取1±0.05g 蜂蜜样本于离心管中，加入2ml1%三氯乙酸，振荡2min，室温4000r/min以上，离心10min；
2、 取出100μl 上清液于另一试管中，加入1900μl 样本复溶液稀释，混合30s；
3、 取50 μl 用于分析
    样本稀释倍数: 40 倍
【 酶标免疫分析程序】
测定前应须知：
1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2、 使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、 在elisa 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是elisa 测定程序中的要点。
4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
操作步骤：
1、从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 配制标准液
制备四环素标准应用液：50μl 标准浓缩液用
450μl 稀释好的复溶液稀释并混合均匀，现配现用。
标准液1：50μl 标准浓缩液1 用450μl 稀释好的复溶液稀释 0ppb
标准液2：50μl 标准浓缩液2 用450μl 稀释好的复溶液稀释 0.05ppb
标准液3：50μl 标准浓缩液3 用450μl 稀释好的复溶液稀释 0.15ppb
标准液4：50μl 标准浓缩液4 用450μl 稀释好的复溶液稀释 0.45ppb
标准液5：50μl 标准浓缩液5 用450μl 稀释好的复溶液稀释 1.35ppb
标准液6：50μl 标准浓缩液6 用450μl 稀释好的复溶液稀释 4.05ppb
3、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
4、配液：将40ml 20x 浓缩洗涤液用去离子水稀释至800ml。
5、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6、加标准品/样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗体工作液50μl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀37℃环境中反应30min。
7、将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液250μl/孔洗板4～5 次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
8、每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4～5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
9、显色：加入底物a 液50μl/孔，再加入底物b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。
10、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm 处（建议用双波长450/630nm 检测，5min内读数），测定每孔od 值。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含克伦特罗的含量成负相关。
1、粗略判定：
    用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出
其浓度范围(ng/ml)。假设样本1 的吸光度值为0.3，
样本2 的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：
0ppb 为2.243； 0.05ppb 为1.816；0.15ppb 为1.415；0.45ppb 为0.74；1 .35ppb为0.313；4 .05ppb 为0.155。则样本1的浓度范围是1.35ppb～4.05ppb；样本2的浓度范围是0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素实际浓度。           
1、定量分析：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（b）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（b0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝ b ×100%
b—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
b0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以四环素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
3、标准曲线：
b/b0 (%)
0.05        0.15        0.45       1.35        4.05
                   四环素(ppb) [µg/kg]
           图1：四环素检测试剂盒的回归曲线
4、再现性：
%cv
四环素(ppb) [µg/kg]
                图2：四环素检测试剂盒的精密度
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出四环素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%cv）对相应四环素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
【注意事项】
1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的od值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2m硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、od值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（a450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
8、 该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【储存】
原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。
【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

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